提高水凝胶机械性能的方法及其在骨组织工程中的研究进展
创伤、感染、肿瘤等导致的骨缺损修复是目前研究热点，如缺损超过自身愈合能力，则需要填充自体或者同种异体组织，以促进骨愈合。自体骨移植是临床治疗骨缺损的金标准，但存在骨来源有限及供骨区并发症等问题，临床应用受到限制。因此，骨移植替代物成为骨缺损治疗的理想选择。理想的骨移植替代物应具备良好的成骨诱导和血管生成能力、生物相容性、形状和大小可控、保质期长、成本低等特点。目前，骨移植替代物主要包括同种异体骨、异种骨、金属及陶瓷材料等。与其他骨移植替代物相比，水凝胶具有类骨细胞外基质的多孔结构、良好生物相容性的优点，而且形状、大小可控，能匹配不规则骨缺损，有望成为骨缺损修复材料。然而普通水凝胶机械性能较差，对于负重骨骨缺损，如修复材料机械性能较差，修复后容易变形，无法发挥早期支撑作用。而且，研究表明与骨机械性能匹配的生物材料还有利于骨细胞的增殖及矿化，发挥良好的骨传导和骨诱导作用。因此，提高水凝胶机械性能是改善其修复骨缺损效果的关键因素。目前，有研究通过构建双网络结构、与无机纳米粒子复合、引入导电材料及增强纤维网络等方法来提高水凝胶机械性能，现对上述方法及其制备水凝胶的骨修复效果进行总结，为后续采用高机械性能水凝胶修复骨缺损提供思路。
双网络水凝胶
双网络水凝胶是由两种不同性质聚合物形成的互穿网络，两个网络性质存在显著差异，一种为交联密度较高的聚电解质网络结构（刚而脆），另一种为松散交联的中性网络结构（软而韧）。聚电解质网络结构为双网络水凝胶提供了“牺牲键”，起到分散外界应力的作用；而柔性的中性网络结构填补于聚电解质网络中，为双网络水凝胶提供了支架，保持水凝胶外形。相比于单一网络水凝胶，双网络水凝胶机械性能和韧性均显著提高。因此，双网络水凝胶被广泛应用于骨组织工程的研究。Zhang等通过对甲基丙烯酰基明胶、硫醇化壳聚糖和改性的多面体低聚倍半硅氧烷纳米粒子进行光交联，然后将活性镁离子通过镁的配位键引入系统中，成功制备了一种掺入镁离子的双网络水凝胶。该水凝胶的抗压性能和拉伸性能较单一网络水凝胶明显提高，能有效促进BMSCs增殖和成骨分化，促进大鼠颅骨缺损的修复。Li等以阴离子多糖结冷胶为第1网络，存在交联剂的可聚合单体作为第2网络，通过一步混合法制备了双网络水凝胶，并将2-甲基丙烯酰胺乙基磷酸二氢的单体引入到第2网络中。该水凝胶表现出了良好的压缩性能和流变特性，能有效促进小鼠成骨细胞系MC3T3-E1细胞的骨矿化。Xu等采用双交联法制备了结构和机械性能可调的新型多孔聚乙烯醇/海藻酸钠/羟基磷灰石复合水凝胶，通过调整各成分混合比例，提高了水凝胶的弹性模量，有效促进MC3T3-E1细胞成骨分化，但是其压缩模量与动物、人骨组织相比仍存在差距。Bi等将医用级聚乙烯醇与壳聚糖在氢氧化钾/尿素溶解体系中物理交联，构建了新型双网络水凝胶。该水凝胶显示出高抗压性能，有效促进了兔骨缺损修复，具有作为骨修复材料的潜力。
纳米无机粒子复合水凝胶
Haraguchi等将“新型纳米复合材料”概念扩展到水凝胶领域，并于2002年首次报道制备了具有独特有机-无机网络结构的新型“纳米复合水凝胶”，其具有优异机械特性，被广泛应用于骨组织工程。
纳米生物陶瓷复合水凝胶 生物陶瓷在生物降解性、生物相容性和生物力学特性方面有着独特优势，是骨再生和骨修复的重要材料，分为无机磷酸盐类陶瓷和生物活性玻璃两类，已被广泛用于骨组织工程研究。加入纳米生物陶瓷可以增强水凝胶机械性能，从而增加水凝胶骨修复效果。目前，骨组织工程研究最广泛的无机磷酸盐类陶瓷为磷酸钙类，包括羟基磷灰石（HA）、β-磷酸三钙（β-TCP）以及它们的混合物双向磷酸钙（BCP）。HA构成了骨骼的无机相（约占无机相的65%），是所有磷酸盐分子中生物相容性最强的物质之一，因此可以作为骨移植替代物用于骨修复。HA的加入可以有效提高水凝胶机械性能，随着纳米HA逐渐降解，HA将释放钙离子和磷酸盐离子，这两种离子能够在微环境中调节细胞行为，调节骨骼矿化过程并与周围组织结合，从而促进成骨分化。Wang等利用紫外光交联技术开发了一种新型明胶甲基丙烯胺-聚（乙二醇）二丙烯酸酯-纳米HA复合水凝胶支架，随着纳米HA含量的提高，该水凝胶在40%形变情况下，应力可以达到约300kPa；同时，该水凝胶表现出良好的生物相容性。Liu等的研究利用多巴胺修饰纳米HA，形成聚多巴胺修饰的纳米HA，然后将该物质引入氧化海藻酸钠和明胶的席夫碱反应中，在温和条件下制备了可注射骨修复水凝胶。由于纳米HA的引入，该水凝胶的压缩应力在形变80%时可达到约0.5MPa，大大提高了其修复兔股骨髁缺损的能力。β-TCP和BCP也是增强水凝胶机械性能的材料。Nie等将壳聚糖/明胶水凝胶与BCP纳米颗粒（BCP-NPs）结合在一起，制备了复合水凝胶。随着BCP-NPs含量的增加，复合水凝胶的压缩应力可高达2.5MPa，非常接近骨组织应力参数；与低BCP-NPs含量复合水凝胶相比，高BCP-NPs含量复合水凝胶更好地促进了BMSCs中ALP的生成，在兔股骨头坏死病灶处可见更多新生骨生成。Sen等将琼脂糖和琼脂糖-胶原水凝胶与不同比例的β-TCP包埋颗粒相结合，得到不同性能的复合水凝胶；随着β-TCP比例的增加，复合水凝胶压缩模量可达到近300kPa，机械性能较普通水凝胶明显改善，并在体外有效促进人BMSCs增殖及成骨分化。
与无极磷酸盐类陶瓷相比，生物活性玻璃无论是在生理溶液中还是在体内都表现出较快的磷灰石生成能力，可以有效改善细胞黏附，促进成骨细胞增殖、分化及矿化。研究表明，添加生物活性玻璃可以有效增强水凝胶抗压性能和杨氏模量，从而促进成骨相关细胞成骨分化。Ye等制备了生物活性玻璃-明胶-海藻酸盐水凝胶支架用于骨缺损修复，随着生物活性玻璃比例的增加，该水凝胶支架的压缩应力从1MPa增加至2.5MPa，并有效地促进了大鼠BMSCs的黏附和成骨分化。Killion等通过光聚合开发了生物活性玻璃与聚乙二醇复合水凝胶，随着生物活性玻璃含量的增加，复合水凝胶的杨氏模量逐渐增加，可高达8~9MPa，压缩应力高达2~3MPa。但该研究缺乏体内外相关生物学实验，无法判断其骨修复效果。Wu等采用热触发方式制备的可注射壳聚糖/丝素蛋白/生物活性玻璃纳米颗粒水凝胶，能够显著促进成骨和成血管分化，并在体内实验中显示出改善骨缺损修复的作用，提示生物活性玻璃的加入提高了水凝胶机械性能，有利于成骨分化和骨缺损修复。上述研究表明在水凝胶中加入纳米生物陶瓷是增强水凝胶机械性能，提高水凝胶骨修复效果的有效选择方案。
纳米黏土基水凝胶 纳米黏土颗粒及其复合材料为生物材料的设计和再生医学的发展提供了新思。与其他纳米颗粒材料相比，纳米黏土颗粒在较高浓度时仍表现出很好的生物相容性；同时降解产物不仅无毒性，而且有利于成骨分化，因此在骨修复领域具有广阔应用前景。黏土矿物，也称为片状硅酸盐或层状硅酸盐，是一类无机层状纳米材料，基于其制备的纳米黏土颗粒能通过剥落或嵌入等相互作用与水凝胶聚合网络产生亲和力，从而形成纳米黏土基水凝胶。与传统水凝胶相比，纳米黏土基水凝胶具有优异的力学性能、流变性能、溶胀能力、生物吸附和生物黏附能力，这些特性使水凝胶具备与骨基质相似力学性能的同时，也不影响其固有的物化性能。目前，纳米黏土颗粒已被广泛应用于骨组织工程，其中锂皂石（Laponite）占据主导地位。大量研究表明，通过添加Laponite获得的水凝胶-Laponite复合材料，其杨氏模量与单纯水凝胶相比显著提高，例如聚乙二醇二丙烯酸酯-Laponite复合材料提高1.9倍，明胶-Laponite复合材料提高3.3倍，明胶甲基丙烯酸酯-Laponite复合材料提高4倍，藻酸盐-Laponite复合材料提高7.4倍。将聚环氧乙烷中的Laponite浓度从40%提高至70%，可促使成骨相关基因明显上调，同时促进矿化结构和ALP活性在28d内提高10倍，大大改善了成骨分化效果。Laponite可以与带电聚合物形成可逆的静电键，能够动态形成和断裂，使Laponite成为设计可注射水凝胶的理想候选材料。Liu等开发了一种可注射的原位成型纳米复合水凝胶，由明胶、藻酸盐和Laponite组成，Laponite硅酸盐的加入提高了水凝胶机械性能，进而促进颅骨缺损部位新骨生成。此外，用于骨组织工程的纳米黏土还有高岭土、蒙脱石及海泡石等。Ou等采用光聚合反应制备的纳米银/高岭土纳米管/明胶甲基丙烯酸酯混合水凝胶，较普通水凝胶具有更好的机械性能和生物活性，能有效促进人牙周膜干细胞的成骨分化以及大鼠颅骨缺损部位新骨生成；Pietraszek等将载有ALP的埃洛石混入壳聚糖-胶原水凝胶支架，明显提高了基础水凝胶的储能模量，同时有效促进了人成骨肉瘤细胞MG-63细胞的增殖和黏附。Cui等制备甲基丙烯酸二醇壳聚糖-蒙脱土纳米基水凝胶用于骨缺损的修复，研究发现当蒙脱石含量从0.5%增加至4%时，该水凝胶的杨氏模量从10kPa增加至60kPa以上；体外实验表明蒙脱石含量为1.5%时，该水凝胶表现出最佳的生物相容性，并显著提高BMCs的成骨分化能力；体内实验进一步证明该水凝胶能够有效促进小鼠颅骨缺损部位骨组织生成。
导电材料引入水凝胶
骨组织中存在着内源性电场，并在骨组织的生理、病理改变中起着重要作用，而普通水凝胶不具备导电性，研究表明提高水凝胶导电性可以有效提高其骨修复能力。导电材料的引入不仅增加了水凝胶导电性，也增加了其机械性能，对促进骨修复起到了协同作用。常见的导电材料有金属纳米离子、导电聚合物、碳基材料及其混合物。
金属纳米粒子及金属氧化物颗粒 常用的金属纳米粒子有金、银、铂等及其氧化物。Ribeiro等制备了含银和金纳米粒子的抗菌丝素蛋白/纳米HA水凝胶，水凝胶机械性能增强，并且呈浓度依耐性，同时与成骨细胞共培养实验显示出良好的生物相容性；DongHeo等将金纳米粒子引入明胶水凝胶，使水凝胶机械性能得到增强，有效促进了MSCs和MC3T3-E1细胞的成骨分化。但是这些金属纳米粒子具有毒性，所负载的浓度往往有限，所以对水凝胶机械性能的改善也很有限。Celikkin等将制备的甲基丙烯酰明胶-金纳米粒子水凝胶用于骨组织工程研究，与单纯甲基丙烯酰明胶相比，该复合水凝胶压缩模量仍然维持在2~3kPa，金纳米粒子载入并未使其机械性能得到有效改善。
金属氧化物具有导电性、磁性及抗菌性，既往研究已经证明了其良好的生物活性。磁性氧化铁纳米颗粒，作为最常用的金属氧化物颗粒，与生物材料组合可以刺激成骨细胞增殖和分化。Lin等采用3D打印技术制备了氧化铁水凝胶支架，并将7F2成骨细胞接种于支架表面进行培养，结果显示该支架能有效促进细胞增殖及成骨分化。但是这项研究主要关注磁性对于成骨的影响，机械性能改善对成骨的影响有待于进一步研究。Farzaneh等的研究制备了负载钴铁氧体纳米粒子的水凝胶，随着钴铁氧体纳米粒子含量的增加，水凝胶机械性能逐渐增强，并表现出了明显促进细胞增殖和分化的作用，但是缺乏体内实验的结果。因此，金属纳米粒子可以在一定程度上改善水凝胶机械性能，但不是增强水凝胶机械性能的第一选择。金属氧化物对水凝胶机械性能的影响及与成骨的关系需要进一步研究。
碳基导电材料 石墨烯和碳纳米管作为主要的碳基导电材料，已经被证明具有良好的生物活性及骨修复作用。而且，石墨烯和碳纳米管具有优异的机械性能。石墨烯可通过氢键、静电、疏水等方式与水凝胶发生相互作用，进而决定了水凝胶的结构和复合水凝胶的机械性能，例如弹性模量、韧性和拉伸性能。Zhou等制备了氧化石墨烯/胶原蛋白水凝胶，其弹性模量比单纯胶原蛋白凝胶高约4倍，经过与人BMSCs复合培养，发现氧化石墨烯/胶原蛋白水凝胶能促进人BMSCs的成骨分化，这一发现提示氧化石墨烯通过改善水凝胶机械性能，进而促进了细胞的成骨分化。Nosrati等采用3D打印技术制备了明胶/HA/石墨烯支架，石墨烯的加入使支架压缩模量由0.26MPa增加到0.43MPa。Jiao等制备了明胶-还原型石墨烯水凝胶，用于BMSCs双向分化的研究。随着石墨烯含量的增加，水凝胶压缩-形变曲线发生明显变化，当形变在50%左右时，压缩模量可达到100kPa以上，大大改善了水凝胶机械性能；体外实验提示该水凝胶能有效促进BMSCs成骨和成血管分化，体内实验证实其通过促进成血管和成骨显著改善骨缺损修复。Li等研究了氧化石墨烯-HA-藻酸盐水凝胶复合物，氧化石墨烯的含量从0增加到1.2%时，水凝胶复合物压缩应力由（64.1±4.0）kPa增加至（174.2±9.3）kPa，弹性模量由（80.3±7.4）kPa增加至（158.3±6.9）kPa，氧化石墨烯浓度为1.0%时，在细胞增殖和分化以及体内骨缺损修复方面均表现出了最优效果，与单纯HA-藻酸盐水凝胶相比，氧化石墨烯改善了水凝胶体系的机械性能，从而促进了骨组织修复。Cui等采用3D打印技术制备了聚离子复合物/多壁碳纳米管高硬度复合水凝胶，与单纯的聚离子复合物水凝胶相比，其断裂性能得到改善，与大鼠BMSCs共培养表现出良好的生物相容性，且能有效促进成骨相关基因的上调和矿化结构的生成；同时体内实验证实其可促进大鼠颅骨缺损修复，这些可能得益于机械性能的改善。因此，碳基材料不仅可以增强水凝胶导电性，而且可以提高水凝胶机械强度，从而促进骨缺损修复。
导电聚合物 添加导电聚合物也是增强水凝胶机械性能的有效方法，常见的导电聚合物包括聚吡咯、聚苯胺、聚噻吩、聚（3,4-亚乙基二氧噻吩）等。既往研究表明，导电聚合物可促进细胞增殖、成骨分化，有助于骨缺损修复。Yang等设计了透明质酸和聚吡咯的导电水凝胶，该复合水凝胶的杨氏模量是普通透明质酸水凝胶的5倍，机械性能明显改善，同时具有良好的细胞相容性，但缺少用于骨修复的研究结果。其他导电聚合物虽然已经证实可以促进组织修复，但是由于本身机械性能较差，所以不能有效改善水凝胶机械性能。Sawyer等构建的甲基丙烯酸明胶-聚苯胺水凝胶虽然表现出了良好的细胞相容性，但是随着聚苯胺浓度的增加，该水凝胶压缩模量反而逐渐下降，因此有待进一步研究导电性增加和机械性能下降对于骨修复的影响。通过添加两种或者多种导电材料制备水凝胶，不仅可以提高水凝胶导电率，也能改善机械性能，解决了单一导电材料对水凝胶机械性能改善有限的问题。Liu等使用两种导电材料碳纳米管和黑磷开发了一种复合导电水凝胶，该水凝胶在兼具良好导电率的同时，表现出了较高的压缩应力，进一步体外实验证明其能促进MC3T3-E1细胞增殖、黏附和分化，同时在体内加速了兔股骨缺损的修复和脊柱融合。添加两种或多种导电材料为增加水凝胶的机械性能和改善骨修复效果提供了新思路，在水凝胶促进骨修复方面具有广阔研究前景。
纤维网络增强水凝胶
与传统组织工程材料相比，水凝胶的应力-形变表现为非线性弹性或非弹性行为。而且，水凝胶的刚度很大程度上受纤维定向和水运动的影响。具有比各向同性基体更高刚度的纤维可以增强水凝胶的机械性能，同时与普通水凝胶相比，纤维网络增强水凝胶更接近细胞外基质，从而改善细胞功能，因此具有广阔应用前景。Lin等将物理交联与化学交联制备的水凝胶注入到3D打印的热塑性弹性纤维网络中，高强度而有弹性的纤维加入使复合材料在适度形变时具有很高的模量；Illeperuma等采用钢丝绒纤维增强所制备的海藻酸盐-聚丙烯酰胺水凝胶、Agrawal等采用聚氨酯混合弹性纤维增强所构建的环氧胺水凝凝胶，与普通水凝胶相比均表现出了较高的机械性能，证明了纤维网络增强是制备高强度水凝胶的有效方法。越来越多的纤维网络增强水凝胶被应用于骨组织工程的研究。Xu等将聚（丙交酯-共-环氧乙烷）水凝胶前体溶液涂于电纺聚（L-丙交酯）纤维网，并将其层层堆叠，通过交联产生层压纤维增强复合水凝胶。该复合水凝胶与普通水凝胶相比，机械性能得到明显增强，并且体外实验证实其可以促进BMSCs成骨分化。Dubey等将采用熔体电写技术制造的聚己内酯网集成到甲基丙烯酰明胶中，构建了聚己内酯增强的甲基丙烯酰明胶水凝胶，聚己内酯的加入使该复合水凝胶在20%以内的形变下，应力可达到近70kPa，大大改善了水凝胶的机械性能，并且该纤维网络水凝胶能够促进人MSCs的增殖、黏附及分化，同时在体内实验表现出明显的骨缺损修复效果。因此，纤维网络增强能够改善水凝胶机械性能，从而进一步提高水凝胶骨缺损修复的能力。
结论与展望
通过改变水凝胶成胶的体系、组分以及纤维结构，可以不同程度改善水凝胶机械性能，如杨氏模量、压缩应力、压缩形变、屈服应力等指标，并且在体外和体内实验均表现出了良好的骨修复效果。不同增强水凝胶机械性能方法各有局限，两种或以上方法联合使用可以一定程度弥补各自不足。但是目前关于提高水凝胶机械性能用于骨再生的研究仍存在一些问题：①部分水凝胶用于骨修复的研究中，缺乏水凝胶机械性能相关参数结果、机械性能相关参数单一。应力-压缩曲线是反应材料机械性能的重要参数，但是进行相关检测的研究较少；单纯压缩应力、弹性模量等指标不能有效反应水凝胶的机械特性，无法作为骨修复材料的参考。相关研究选择的指标各异，不同的机械性能参数无法做横向的比较，从而无法明确机械性能在促进骨修复方面的真正作用。②经上述方法改善的水凝胶虽然表现出一定骨修复效果，但是其机械性能仍无法达人、动物骨组织，尚不能将研究结果转化用于临床。③添加无机颗粒虽然能增强水凝胶机械性能，提高其骨修复效果，但是骨修复的作用是因为无机粒子本身、体系机械性能增加或是二者皆有尚未明确。因此。有待于更多、更规范、更细致的关于提高水凝胶机械性能应用于骨修复的研究，从而为骨组织工程提供新的理论依据。
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